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一、卵巢组织冻存及移植概述

1. 放化疗患者面临卵巢早衰的风险

卵巢是女性重要的内分泌和生殖器官,对女性具有重要意义,一旦受损或功能丧失,将严重影响女性的生活质量。近 30 ,女性癌症患病率增加 20% ,而由于癌症治疗技术的进步,大剂量化学治疗和 /或放射治疗联合骨髓移植治疗方案的应用 ,青春期和年轻育龄妇女恶性肿瘤病人中 90% 病人得以生存。由于女性卵巢对放化疗毒性非常敏感 ,其生殖内分泌功能会受到辐射或药物毒性损

,愈后面临卵巢功能衰竭的问题。

2.生育力保存方法

如何挽救卵巢功能,保存这些女性患者的生殖能力,医学界一直在不断探索。目前保存生育力方法主要有两大类 :临床手术或药物干预及细胞 /组织冷冻技术。前者主要指临床上对宫颈癌早期、恶性程度低的病人 ,在盆腔放疗前通过卵巢悬置手术保护卵巢功能免收辐射损伤;对卵巢上皮性早期浸润癌病人进行保守手术;对子宫内膜癌早期病人进行激素治疗。近期临床研究显示化疗前接受药物预处理可缓解化疗药物对卵巢功能的毒副作用。一般主张在化疗前7-10 d使用促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)来保护卵巢功能。后者包括胚胎冷冻、卵母细胞冷冻和卵巢组织冷冻。卵母细胞冷冻和胚胎冷冻技术,以及联合未成熟卵母细胞体外培养成熟,已经成功地用于保存女性生育力。但是该技术受到生育伴侣、配偶及宗教、伦理等社会因素的限制,且不适用于青春期前少女。而且,有些癌症患者,不宜通过卵巢刺激促排卵治疗而取卵。相比较而言,目前正在完善的卵巢组织冻存移植技术有着较大优势。

二、卵巢组织冻存及移植技术

1.卵巢组织冻存移植的历史

卵巢冻存移植是指患者在放化疗前,将其卵巢组织取一部分冻存起来,待患者痊愈后再将冷冻的卵巢组织移回自体,达到同时保持女性卵巢的内分泌功能和保存生育力的双重目的。具体地说,卵巢冻存技术可同时保存数百个不同成熟度的卵泡,不需药物促排卵,不会延误癌症的最佳治疗时间;患者日后可通过自体移植或分离出卵泡进行体外培养来获得成熟卵母细胞,而且还能在一定程度上恢复卵巢的内分泌功能。1960Parrott首次成功地将大鼠卵巢组织通过慢速冷冻法冻融后自体移植,成功妊娠并产下幼仔。到2004年,Donnez1例霍奇金淋巴瘤病人进行了冻存卵巢组织原位移植手术,病人3个月后再现卵巢周期并出现卵泡发育、血清雌激素含量升高, 实现了自然妊娠并成功分娩1女婴,为世界首例,开创了卵巢组织冻存移植临床应用的先河。目前癌症患者卵巢组织冷冻保存及再植技术在部分欧美国家仍然得到了比较广泛的应用,乳腺癌、淋巴瘤及卵巢肿瘤等多种患者在治疗后成功获得生育力。截至2011年为止,世界上共有12名肿瘤及血液系统患者在战胜病魔后接受了卵巢组织解冻移植,她们在术后3-5个月自然地恢复了月经来潮,并在术后1-2年在没有接受任何辅助生育技术治疗的情况下,完全自然地怀孕,并一共诞下17个健康的婴儿,个别患者甚至生下了3个孩子;

冻存的卵巢组织维持正常功能的时间会因每个患者的情况各异而有所不同,目前的技术至少能保存 20 年,每次解冻移植通常只复苏患者的部分卵巢组织片,如果第一次移植的组织功能耗竭,可解冻余下的卵巢组织并再次移植,仍可获得天然的卵巢激素和自然受孕机会。

2.卵巢冷冻保存的方法

癌症病人因治疗时间紧迫或禁忌症等原因不能接受超排卵而冻卵或冻胚,可选择冻存卵巢组织方法保存生育力。人卵巢组织结构复杂,含有不同类型的细胞,如基质细胞、卵泡、颗粒细胞、膜细胞。卵巢冷冻过程中,CPA 是通过基质和颗粒细胞渗透到卵母细胞,而CPA 对不同类型细胞的保护作用不尽相同,冷冻速度也有差异。因此,针对这种多细胞体系的冷冻对象,如何选择低毒性、渗透性好,并能减少冰晶形成的CPA,以及最佳冷冻速率是亟待解决的问题。

卵巢组织的冷冻保存主要有玻璃化冷冻和慢速冷冻两种技术。程序化冻存法是采用冷冻仪按设置的程序进行冷冻, 效果稳定。但冷冻过程时间长。程序冷冻的冻融方案多以Oktay 等提出的慢冻- 快融的方案为基本方案。它包括: 将卵巢组织块放置预冷的缓冲液- 1.5 mol/L 的二甲亚砜( DMSO) , 5%-10% 的牛血清( 或加 0.1 mol/L 蔗糖或甘露糖) 中平衡 30min; 将装有组织块的冷冻管放置冷冻仪, 0℃开始, 2/min 的速度降至- 7 ; - 7℃ 植冰,在植冰前平衡10min;再以 0.13/min 的速度降至- 40 ; 10/min 的速度降至- 140;投入液氮中保存;解冻在 37℃ 、60 r/min 的水浴振荡器内完成。需要时, 以加温 100/min 的速率快速解冻。组织用梯度递减的蔗糖溶液洗涤, 以置换出冷冻保护剂。早先冻存人卵巢组织主要采用慢速冷冻方案。目前多采用玻璃化冷冻法。

玻璃化冷冻法是RALLFAHY1985)在冷冻小鼠6-8细胞胚胎时建立的一种快速,简捷而又有效的超低温冷冻法。它采用高浓度冷冻保护剂组成的玻璃化液(渗透和非渗透性保护剂相结合),这种溶液在低温下变粘稠,不发生结晶即可固化,此固体物质能保持分子和离子正常的液态分布,是一种经济、高效的冷冻模式。玻璃化冷冻其高浓度冷冻保护剂和细胞间经一定时间平衡后,细胞体积可因脱水而减少30-50%,然後将之置入冷冻器材,再直接投入液态氮中使细胞瞬间玻璃化,在无冰晶形成下保存,以减少细胞内结冰造成伤害,从而改善慢速冷冻之缺点。目前,玻璃化冷冻法未形成统一的冷冻保护液和冷冻程序,但是普遍认为EFS溶液(EGF(聚蔗糖))及DMSOEG等量体积对半混合为最好的玻璃化液。可将渗透性CPA 的浓度降低30% ,减弱毒性效应。

不论采用何种冷冻方法,研究表明,窦前卵泡中的卵子对冷冻损伤最为敏感,而始基卵泡对冷冻、复苏以及移植后的缺血损伤的耐受性最好,因此是卵巢组织冷冻保存的主要目标卵泡群。经过玻璃化冷冻,卵巢组织中近90%的卵泡可以得到保存,而慢速冷冻之后,仅42%的卵泡能经受冷冻和复苏的考验。因此,玻璃化冷冻是目前卵巢组织保存的首选方法。

无论是慢速冷冻还是玻璃化冷冻卵巢组织,均有两个难题需要攻克:一是冷冻保护剂在卵巢组织块内渗透性差和细胞毒性;二是移植后组织缺血损伤和血供重建。此外,冻存卵巢组织中是否携带肿瘤细胞,关系到移植安全性问题。目前这些问题尚未有效解决。但是近年来人卵巢组织冻存联合自体原位或异位移植方法,成功报道逐渐增多,经过进一步探讨和改进后,将是保存女性生育力的理想途径。

3.冻融卵巢移植的方法

冻存卵巢组织可以通过自体原位或异位移植,恢复病人内分泌功能和排卵功能。自体卵巢冻存后原位移植作为最理想的保存生育力方法。自从2004年第一例女婴诞生于肿瘤病人冻存卵巢组织原位移植术后自然妊娠,目前已有17例健康婴儿来自于肿瘤病人的卵巢组织慢速冻存后移植术。而且上述病例中冻存卵巢组织移植部位均为卵巢原位,因此有可能病人排卵是来自残留卵巢。

研究证实,冻存卵巢组织异位移植后也能恢复排卵功能。卵巢组织异位移植需要在穿刺取卵手术、IVM、体外受精和胚胎移植等技术的帮助下,才有可能获得生育,目前尚未有活婴分娩报道。2004年,Oktay报道第一例人冻存卵巢组织皮下移植后获得未成熟卵母细胞,经体外培养成熟后受精并发育到4- cell期胚胎。Rosendahl从异位移植的卵巢组织中取得1枚成熟卵母细胞,ICSI后受精发育至5- cell期,移植后病人获得生化妊娠。可是,Oktay2006年报道1例病人接受冻存卵巢组织异位移植后自然怀孕并成功分娩,该病例提示残留卵巢在移植卵巢组织的影响下有可能恢复排卵功能。

而玻璃化冷冻方案在冻存人卵巢组织后移植应用未有成功报道。动物研究表明,玻璃化冷冻方案也可有效保存卵巢组织。Yin等人采用5. 5MEG玻璃化冻存牛卵巢组织,效果与慢速冷冻相似。ChenWang等人采用EG/DMSO方案玻璃化冻存小鼠卵巢组织,原位或肾包囊下移植后获得子代小鼠。

由于卵巢皮质中的始基卵泡几乎全部聚集于距离皮质表面0.75mm以内的组织中,获取的卵巢皮质应被裁剪成厚度为0.75-1mm的薄组织片,这一点对最大限度地获取始基卵泡、获得最佳的冷冻效果以及在术后快速建立卵巢皮质血供都至关重要。此外,精细的显微缝合、术中持续的冲洗亦有助于预防微血栓的形成,从而降低术后卵巢皮质组织缺血损伤的风险,提高卵巢组织复苏再植的效率。尽管如此,由于在冷冻复苏和再植后血管新生未完成时,仍然可能存在长约3-4天的缺血窗,在此期间仍然可能有一部分卵泡由于氧化应激等原因闭锁、丢失。因此,一次手术移植的500-1,000枚窦卵泡中,将有超过50%由于缺氧等原因而丢失。所以,移植术后的患者虽然可以重获生殖功能,但仍然具有低储备、低反应的病理特征。

三、保存生育力技术的适用征

1.卵巢功能早衰病人:卵巢功能早衰是指女性40岁以前出现绝经或下丘脑性闭经,患病率高达1%。这部分病人可以考虑尽早保存生育力。

2.癌症病人:美国每年有600000人被确诊为癌症,其中1/10病人年龄在40岁以下。化疗后癌症病人,尤其是采用烷基化药物,卵巢早衰的风险增加9,其中21- 25岁女性病人卵巢早衰风险高达约27,儿童病人化疗后卵巢早衰发生率高达60%。化疗、全身放疗联合骨髓移植治疗,卵巢毒副作用更明显,80%的儿童病人面临卵巢功能早衰。

3.自体免疫性或血液系统疾病的病人:自身免疫性或血液系统疾病的病人,接受大剂量化疗/放疗后,有卵巢功能衰竭的风险,可考虑保存其生育力。

4.妇科手术病人:妇科手术病人术后也可能出现卵巢功能衰竭。严重子宫内膜异位症累及卵巢行内膜异位灶清除术后,病人卵巢功能可能受到影响而衰竭。因此,严重子宫内膜异位症病人,亦可通过保存生育力技术来为自己的生育提供保障。

5.要求推迟生育的病人:因个人、职业或经济等社会因素推迟生育计划的女性越来越多。10%的女性在32岁开始出现卵泡大量闭锁,37.5岁以后卵泡闭锁加剧。因此,对于需推迟生育的女性,在30岁以前保存卵母细胞、胚胎或卵巢组织,无异于为生育力做备份。

四、卵巢组织冻融后移植的风险及指征

卵巢组织冷冻以及再植应用于癌症生育力保存中的主要问题,是恶性肿瘤再植的风险评估。来自丹麦的研究结果表明,62名女性恶性肿瘤患者中,只有1名已经出现全身转移的晚期乳腺癌患者卵巢皮质中可以看到恶性肿瘤细胞,而在其他61人的卵巢皮质里,研究者们并未观察到肿瘤细胞的踪影,其中包括数例白血病患者。有作者认为,这一现象的出现是因为聚集始基卵泡的卵巢皮质最外层间质以致密纤维结缔组织为主,血供稀少。在这一新兴技术中,卵巢组织中肿瘤细胞的灵敏、全面检测是实现其安全以及广泛应用的关键问题。因此,目前多数专家仍然主张对来自肿瘤患者的卵巢组织进行微小残留(MRD)的检测,以降低肿瘤细胞随卵巢组织再植到患者体内的风险。近年来MRD检测的常用技术包括肿瘤特异性的融合转录片段、异常染色体、重排的免疫球蛋白和T细胞受体的PCR检测,激光捕捉微切割(Laser Capture Microdissection)、免疫组化、免疫印迹法(Western Blot)X-连锁的抗凋亡蛋白以及Fas配体检测,以及异常免疫表型的流式细胞检测等。然而,由于目前的MRD检测技术仍有较大的局限性,在术前的知情告知中,肿瘤的微残留可能应得到充分的解释;事实上,这一可能性常成为左右医患双方决策的重要因素。

肿瘤微残留虽然是难题,但MRD检测并非唯一的出路。目前有研究者提出以卵母细胞体外成熟(IVM)作为解决问题的策略。在对获取的卵巢皮质进行切割以及冷冻之前,如果其中尚有肉眼可见的窦卵泡存在,可以将其中的生发泡期(GV)卵细胞抽吸出来,去除部分卵丘颗粒细胞,然后以改良的玻璃化冷冻程序对其进行冷冻保存。通过这一处理,冷冻保护剂将更容易进入卵子,同时又能保留足够的卵丘颗粒细胞来进行解冻后的体外成熟培养。这一技术的好处是,如果患者的卵巢皮质被证实存在恶性肿瘤转移,由此获得的体外成熟卵子仍然可以为其创造受孕的机会。

五、结语

随着恶性肿瘤等疾病发生和诊断的年轻化以及治疗技术的进步,患者生存期已得到显著的延长;同时,生育力保存也逐渐成为癌症治疗中具有重要生理及社会意义的环节。综合考虑原发病及治疗的种类和方案等因素后,育龄女性生育力受损的程度可以得到估计,而在多种生育力保存措施中,卵巢组织冷冻保存及再植有望成为金标准。然而,由于存在恶性肿瘤微残留的风险,这一技术的临床应用目前受到一定的限制。肿瘤细胞微残留检测技术以及卵母细胞体外成熟的发展可能为这一难题的解决提供有力的支持。