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生殖细胞、胚胎和卵巢深低温冻存移植技术是育龄期化疗妇女保持生育力的可选择方法,这些方法的应用直接关系生育力保存是否有效。本节课我们将对低温冻存机理及常用方法、胚胎的深低温冷冻、卵母细胞及胚胎的深低温冻存内容进行阐述。

一、低温冻存机理

()生物材料的深低温冻存概念

生物材料的深低温冻存是指将活的生物材料采用特殊的保护剂和降温措施进行冷冻,使其代谢停止或者减弱到足够小的程度,但又不失去升温后恢复代谢的能力,从而能长期保存生物材料的一种技术。-196(液氮)是最佳的生物材料冷冻保存温度。惟一可能造成细胞损害的因素是来源于外界的物理辐射,由于环境中辐射引起活细胞的自发突变率只有1%,所以目前认为生物样品可以被储存数千年之久。组织虽能在低温下长期保存,但却极易在冻融过程中遭受损伤而死亡。故需要采取一定的保护措施将冻存损伤降到最低。要江少生物材料冻存中 的损伤,我们必须了解冻存可能对组织细胞造成哪些损伤。

()冷冻损伤原理

1.冷冻损伤原理

细胞生活在细胞外液中,细胞膜将细胞内容物(各种细胞器和细胞内液)与细胞外环境分隔开来,而细胞膜是半透膜,水分可以自由通过。水分出入细胞的因素取决于生物细胞内外液中溶质的浓度差。从这张图中我们来复习一下什么是渗透

溶液渗透压的高低与溶液中溶质分子的物质的量的多少有关,溶液中溶质分子物质的量越多,渗透压越高,反之则越低。

2.低温冻存及解冻中的物理化学过程

冷冻时发生的物理化学过程:溶液的固化(冻结)过程、固化溶液的融化过程中、水分通过细胞膜的渗透过程。在这个过程中引起细胞内溶液中冰晶的形成和生长、溶液的再结晶、细胞内外高渗透压应力的保护和高浓度低温保护剂对细胞的毒性等。我们可以说低温冻存及解冻所致的细胞死亡主要有三种方式:胞内冰的形成损伤、溶质损伤、低温保护剂毒性损伤。

不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化,造成不同的损伤。

3.慢速冷冻损伤

慢速冻存主要产生胞内冰的损伤和溶质损伤。

1)细胞内冰晶损伤(ice damage),指冷冻过程中冰晶的形成对细胞造成的胞内冰损伤。若胞内形成的大冰晶,可对细胞产生机械性破坏,引起膜的脂蛋白结构、细胞器的破坏,导致细胞死亡。这是一幅在低温显微镜下拍摄的小鼠卵在1.5M DMSO中以32/min 速率降温时冰晶形成图像:A:0℃状态,无冰晶形成;B.-3℃,细胞所处液体环境开始结冰;C.-20℃细胞外界环境完全结冰;D.-30℃细胞内完全结冰。这个图像说明组织细胞被慢速冷冻时,通常细胞外溶液先结冰,此时,冰晶与溶质分离,使细胞外液未冻结部分液体的溶质浓缩,导致细胞外液渗透压升高,为了保持平衡,细胞内的水分不断外渗,直至冷却到足够的温度,细胞内才结晶。

2)渗透性损伤:在冷冻降温过程中,随温度下降,溶液中的水分逐渐凝结成冰,导致细胞外渗透压增高,细胞暴露于高渗透压、高离子浓度的有害环境中,引起脂蛋白复合物的变性和部分类脂质的丢失,增加细胞膜对阳离子的通透性,在细胞膜上形成一些小孔,细胞因此会受到渗透性损伤。冷却速率越慢,细胞在高浓度电解质溶液中所处时间就越长,此损伤就越大。

3)过冷液体温度波动造成的损伤:水或溶液在温度达到冰点温度时不结冰,直至温度下降到冰点以下或远低于冰点温度时才结冰,这种现象称为过冷现象,此时的液体称为过冷液体。在过冷状态下的突然结冰会导致温度上升。细胞往往在温度的上下波动中死亡。此外过冷液体无控性结冰,会使细胞脱水不完全,而形成细胞内冰晶。应用合适的冷冻保护剂及冰点下人工植冰(seeding)可以最大程度地避免胚胎在缓慢降温过程中受到理化损伤。

4)其他:通过对红细胞冷冻损伤的研究,Meryman1968)认为,慢速冷冻损伤不是来自浓缩的电解质本身,而是来自当红细胞在自身因渗透性皱缩到55%以下时,丧失了继续皱缩和排出水份的能力。结果瞬间的跨膜压力梯度的形成,导致细胞膜破裂。另外Levitt1962年)提出了冷冻生物应力的假设,认为缓慢冷冻时,细胞严重脱水, 体积急剧收缩,造成蛋白质分子异常靠近,形成二硫键,这种键在解冻时的蛋白质重新水化过程中,不能恢复到天然结构,使蛋白质出现不可逆的聚集和变性。

尽管慢速冷冻损伤的机制说法不一,但多数研究者认为,冷冻过程中,冰晶损伤和溶液损伤是同时发生的,而后者是主要的。

4.快速冷冻损伤机制

胞内冰晶形成是引起损伤最主要的原因,在无有效措施的保护下,若冷却过快,胞内水来不及通过细胞膜渗出,则胞内溶液结冰。冷却速率越快,此损伤越大。冷却速率越快,此损伤越大。然而,并不是所有的冰晶都对细胞造成损伤。需要说明的是,当冷冻速度非常快时,细胞内则形成十分细小的冰晶,若复温适当,对细胞无害。让我们来看这三幅画面,这是在不同降温速度下形成冰晶的大小。这是1/min降温速率下形成的冰晶较大,这是100/min降温速率下形成的冰晶较小,这是直接投入液氮时形成的冰晶最小。需要主要的是若快速冻存后实施慢速解冻,则这种小冰晶有可能增大,同样会对细胞造成致命损伤。

5.解冻时的损伤

在解冻过程(thawing)中则发生与冷冻过程方向相反的溶液效应,冰晶首先在细胞外液融化,从而使细胞外液的渗透压降低,细胞内液渗透压相对较高,细胞外的水迅速顺渗透压梯度流入细胞内,造成细胞水肿直至崩解而死亡。也就是渗透休克损伤。二是当复温至-120℃或-100℃以上时,如果复温过慢,也会导致细胞内细小的冰晶重新结晶,成为大的冰晶而导致细胞损伤。

归纳上述内容可以得出冷冻损伤冰晶形成和溶质损伤是冻存过程中面临的主要损伤,而解冻时则会面临细胞遭受渗透休克和再结冰的打击。因此必须寻求适当的措施来加以保护,以提高生物材料冻存后的存活率。这就是下面我们要了解的低温保护剂。

(三)低温保护剂的分类及作用机制

1.冷冻保护剂(cryoprotectent agents,CPA)

在冷冻生物材料时,向细胞保存液中加入一定量的化合物来保护细胞,可防止细胞内形成冰晶、溶质浓度增高以及蛋白质变性。低温保护剂(抗冻剂)就是这样一类物质,它们与水结合后,可避免或减少结冰的程度与速度,或仅结成较小的冰晶。最主要的作用是可以降低冷冻过程中由于盐浓度升高而造成的溶质损伤,从而使细胞安全降温至-196℃。

理想的低温保护剂作用应该是能迅速而均一地穿透入细胞而不引起膜两侧过高的渗透压损伤;有效地结合细胞内水分而控制冰晶生成的大小与速率;安全无毒或低毒。1949年英国的 Polge Smith 等研究者在偶然的情况下发现甘油可提高精子冻存后的成活率,从此,冷冻保护剂的研究如火如荼的开展起来。

2.低温保护剂的分类及作用机制

低温保护机制可分为以下几类:渗透性低温保护剂、非渗透性低温保护剂和

抗冻蛋白。

1渗透性保护剂:渗透性保护剂多为低分子化合物,可透过细胞膜渗入细胞内,易结合水分子,发生水和作用,使溶液的粘性增加,从而弱化了水的结晶过程,达到保护目的。这是他们的分子结构式。

这类保护剂如甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇和丙二醇(PROHEG)等。适用范围最广的是DMSO,它能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点,延缓冷冻过程,同时提高胞内离子浓度,减少胞内冰晶形成,从而减少细胞损伤。然而DMSO具有细胞毒作用,可与细胞中的蛋白质结合,损伤细胞。

2非渗透性低温保护剂(使细胞脱水,稳定细胞外液的渗透压)

小分子糖类:该类保护剂包括蔗糖,半乳糖、乳糖、果糖、葡萄糖和海藻糖(trehalose)。这些物质虽不能进入细胞,但可通过改变胞外渗透压引起细胞脱水而发挥非特异性保护作用。同时它们基本对细胞无毒。

高分子聚合物:这类保护剂有羟乙基淀粉、聚乙烯吡硌烷酮、白蛋白、聚蔗糖、葡聚糖、血清白蛋白等。他们可以提高冷冻保护液的粘稠性,提高溶液玻璃态的形成能力,同时对解冻时的细胞膜具有保护作用(保护膜的完整性)。

3抗冻蛋白(Antifreeze proteinsAFP)

AFP是一种新型抗冻保护剂,是在耐寒鱼类或昆虫等动物上发现的一种具有特殊功能的蛋白质。一种能与冰晶相结合的特异性蛋白质,它能阻止体液内冰核的形成与生长,维持体液的非冰冻状态。在低温(4)和超低温(-130℃~-168),能与细胞膜相互作用,封闭离子通道,阻止溶质渗透,保护膜的完整性,改善细胞膜的稳定性;能够抑制冰晶的生长,增强生物体抵御寒冷的能力。

 

3.低温保护剂的选择

要根据CPA的性质进行。渗透性CPA是冻存液中必须有的成分。而非渗透性CPA 有利于改善保护液的玻璃化性质,提高冷冻保护效果,也能够通过渗透效应促进细胞脱水,稳定细胞膜。常用于快速和玻璃化冻存保护液中。由于很多低温保护剂在产生保护作用的同时,也对胚胎细胞产生毒性作用,故也要根据冻存胚胎的特点选择保护剂。如常规使用PROHEG等醇类作为程序冷冻卵母细胞及胚胎的低温保护剂,与DMSO相比,这些CPA可降低在细胞冻存时的纺锤体损伤。

4.低温保护液的组成

1)首先要注意低温保护剂的合理配伍:渗透性保护剂与非渗透性保护剂的联合使用可达到较好的冷冻前脱水作用。并能有效降低渗透性保护剂的浓度,从而减少其对组织的毒性作用。

2)渗透平衡时间:在最短的时间内达到最大脱水效应是最适渗透平衡时间。

3)最适保护剂浓度:并非保护液的浓度越大越好,在解冻后复苏率相同的情况下选择低浓度保护液。

5.低温保护剂在解冻时的保护作用

为了防止解冻时渗透休克的发生,常需使用解冻液。最常使用的解冻液是蔗糖液。通常根据冷冻方法的不同及冷冻保护液中蔗糖的浓度来确定解冻液中蔗糖的浓度。其原则是解冻液中的蔗糖浓度一定要高于冷冻液,才能在解冻时产生较高的组织细胞外渗透压。当解冻时,蔗糖解冻液与冷冻保护剂在几秒内混合,该混合液中高浓度的蔗糖使细胞外水分内移速度相对受限,从而防止渗透休克所导致的死亡。

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