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慢速冷冻法、快速冷冻法、玻璃化法。这些是冻存需要的冷冻麦管、降温仪及液氮罐。

1.慢速程序冷冻法

1972Whittingham等建立了缓慢冷冻法。将胚胎置于冷冻保护剂中,利用程序冷冻仪或不同温差的冰箱分阶段降温。胚胎的冻存一般分为四个阶段。

首先是从室温将至-5-7℃,再次温度下植冰,在以一定降温速率降至-20℃、-180℃后投入液氮。以缓慢冷冻法采用的冷冻保护剂浓度较低,对胚胎造成的毒性损害小,胚胎解冻后的存活率和移植成活率都较高;在储存和运输时,对于环境温度的变化有更大的耐受力,但操作过程繁琐,费时较长,需要人工植冰,又需要程序冷冻仪,实验成本较高。目前快速冻存方法已被玻璃化方法所替代,下面我们一起来看看胚胎的玻璃化冻存技术。

2.玻璃化冷冻法

玻璃化是一个物理学上的概念,是指当水或溶液快速降温达到或低于-100-110℃的温度范围时,形成一种具有高粘度的介于液态和固态之间的、非晶体态的、杂乱无章的、透明的玻璃状态。它虽然不能像液态那样流动,却可向晶体一样保持自己的形状。其特点为:在玻璃化过程中,分子不重新排列,不发生剧烈运动,没有准确、固定的转变固化点;当水溶液含有电解质或其他可溶性成分转变成玻璃态时,由于其均一的分散系统未遭到破坏,是一种既可以避免或减轻冷冻细胞的损伤,又可长期保存细胞的良好方法。

玻璃化冻存法主要特点是在冷冻过程中运用高浓度的冷冻保护剂,使脱水胚胎及外周的溶液以每分钟20000℃左右速度快速降温,降温后液体粘性增加,不形成冰晶,而变成一种半固体固体状态的玻璃态,其中离子和分子仍正常分布。这种保存方法既避免了由于盐浓度的升高(慢速降温时)对细胞造成的化学性损伤,又防止了由于冰晶形成(快速降温时)造成的物理性损伤,可获得高存活率。不仅操作方法简便,而且冻存效果好,可较好地保存有生命的细胞、组织和器官的生物活性,是近年低温生物学领域最具发展潜能的方法。自1985RallFahy用玻璃化法冷冻小鼠胚胎获得成功以来,玻璃化冷冻已广泛用于生物材料的冷冻保存。在生殖医学领域已成功实现了多种动物及人的精子、卵母细胞、胚胎和卵巢组织的玻璃化保存,并且获得比传统冷冻技术更高的成活率与遗传稳定性。

1)玻璃化冻存程式

主要有两个步骤,一是胚胎或卵母细胞要在低浓度渗透性保护剂中进行预渗透平衡,以保证细胞内渗透性保护剂的有效浓度,然后在将其置于玻璃化液中经较短时间的渗透平衡后投入液氮冻存。

2)要求:①玻璃化冷冻过程中必须有至少一种渗透性冷冻保护剂(DMSO,PG,EG.PROH等),而且浓度要在5-8mol/L,还需要非渗透性冷冻保护剂如蔗糖等。②降温速度越快越好,操作一定要迅速。③玻璃化冷冻液的作用温度。一般以室温为宜。

3)缺点及解决的办法:高浓度的冷冻保护液常温下对胚胎细胞毒性较大,操作过程必须快速、熟练,否则玻璃化液会对卵母细胞产生巨大毒性和渗透性损伤。解决的办法是选择低毒性的或无毒的CPA;并缩短在玻璃化液中的时间。

为了提高玻璃化技术效果,除了较高的细胞内CPA浓度外,提高降温速率是一个关键的环节。而玻璃化过程的样本承载工具的改革为提高降温速率提供了保障。样本承载工具的创新最大限度地减少了待冻样品周围的液体,使样本直接与液氮结束,很快冻结。如开放式细管法、电镜铜网、冷冻环(cryoloop)、冷冻叶(cryoleaf)等。其原理都是通过减少冷冻液的体积提高冷冻和解冻速率,从而提高冻存效果。如Cryotop 的应用使玻璃化溶液终体积由低于1.0μL已减少至0.1μL 冷冻速率达到-23,000/min对卵母细胞的观察显示不影响减数分裂中纺锤体和染色体的排列,避免发生基因异常现象。这些载体可分为开放式和闭合式两种。开放式载体胚胎可以直接接触液氮,虽然提高了降温速率,但还需要找到克服被冻生物材料受病原体污染的机会,故需要防止噬低温菌的污染。方法有2:①滤过液氮,需要专门的滤器;②将OPS装入一个可封闭的套管内,套管里装有滤过的液氮。如通过将Cryoloop Cryotop等保存在2mL的冷冻管内,而解决了液氮污染问题。这些是常用的玻璃化冻存使用的样本载体。

(五)解冻方法

1.大量的研究证明,无论是慢速冻存还是玻璃化冻存,快速复温是最为有效的。

2.保护剂的洗脱

生物材料在解冻过程中脱除保护剂是必要的,这是因为在常温下对生物材料有一定的毒性,而把含较高浓度保护剂的生物材料移植到受体体内或置于等渗培养液中由于细胞内外存在较高的渗透压差大量水分子进入细胞会使其膨胀或崩解。许多实验证明把不脱除保护剂的胚胎移植给受体没有一例妊娠的报道。为了防止细胞在脱除保护剂时过度膨胀在早期实验中采取分步逐渐降低保护剂浓度的做法使胚胎重新水化。但随着蔗糖解冻液的使用,无论是采用慢速冻存还是超速冻存法,解冻时可一次性将生物材料由保护液与解冻液的混合液中移入等渗的改良PBS液或培养液,生物材料活力受损较轻。但对于玻璃化冻存法的解冻,还是主张将生物材料逐次移入蔗糖浓度递减的解冻液更为妥当。

 

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