导航菜单

(一)胚胎冻存

1.历史回顾

1972Whittingham首次报道冷冻复苏小鼠胚胎成功,继而1983TrounsonMohr首次报道人胚胎冷冻、复苏、移植后成功妊娠和新生儿的出生后,胚胎冷冻保存在畜牧业和人类生殖医学领域得到广泛应用。

2.适宜胚胎冻存的癌症病人

准备接受放、化疗的有配偶的妇女,且有生育需求者均可选用该方法。此法要求在进行放化疗前通过超排卵技术和体外受精技术及胚胎培养技术获得胚胎,并将胚胎冻存以备疾病治愈将来之用。

3.可用于冻存的胚胎阶段 

胚胎冷冻是目前已广泛应用的一种较完善的技术,原核胚、4-8细胞期胚、桑椹胚和囊胚都可冻存。解冻后胚胎的存活率为35%90%,植入成功率为8%30%,累积妊娠率>60%

4、胚胎冻存对癌症病人保存生育力的局限性

超排卵治疗需要一定的时间,准备、进入周期实施至结束大约需要23个月的时间,因此可能会延误疾病的治疗。超排卵这一过程对激素敏感性肿瘤的患者会产生不良影响,乳腺癌患者大多在手术治疗6周后化疗,这段时间可以进行超排卵治疗,但超排卵会造成患者体内雌二醇浓度比自然周期中的最高浓度高10倍,所以常规超排卵治疗不适合乳腺癌患者;子宫内膜癌也是对雌激素敏感的恶性肿瘤,他莫西芬会刺激子宫内膜,所以不能用于子宫内膜癌患者。同时,该法不适合儿童和没有配偶的年轻患者,也不能解决患者生殖内分泌问题。

(二)胚胎的冻融方法

1.慢速冷冻——快速复温法是最常用的冷冻原核期及早期分裂期胚胎的方法,这种方法冷冻效果比较稳定。

 

  这是一个常见溶液的配制方法。下面介绍几个发育阶段胚胎的冻存方法。

这是一个采用慢速程序冻存技术对原核期胚卵的冻存-解冻的基本步骤,是生殖中心常规技术,可以在生殖中心完成。

2.玻璃化冻存

目前对培养至囊胚的胚胎进行玻璃化冻存时比较瘦推崇的,解冻后胚胎复苏率可达80.4%。但是由于囊胚内含有大量的水分,使囊胚的玻璃化冻存面临极大的挑战,也使囊胚冻存进展缓慢。近期,人们通过显微针刺及激光在滋养层上打孔技术使囊胚皱缩,避免冰晶形成对囊胚的损伤,提高冻融后的成活率。而激光打孔对胚胎损伤较小。对玻璃化冻存的D5 D6囊胚移植的比较。D5冻融囊胚移植的临床妊娠率、种植率高于D6,流产率明显低于D6,提示D5冻融囊胚移植有利于提高患者抱婴率。

3.复苏后胚胎活性的评价

借助显微镜观察是卵母细胞或胚胎否恢复冻前状态形态学鉴定、体外培养以步观察胚胎生活状态和分裂状况均是直接的复苏后胚胎活性评价方法。复苏后的胚胎如果有细胞溶解、不透明、细胞膜不清楚、细胞退化等现象就表明存活的卵裂球损伤,有50%以上卵裂球存活则认为胚胎存活。染色检查,如通过荧光染色检查死亡的卵裂球。当死亡卵裂球达到一定比例是胚胎将失去发育潜能。而胚胎移植实验是最有力的判断冻存效果的方法。

4.影响胚胎冷冻效果的因素

①胚胎发育阶段:要避免在纺锤体结构的单细胞期和DNA合成期对胚胎进行冷冻,选择可能具有生存能力的囊胚能提高冻存成活率。②冷冻前的胚胎质量

也就是说,选形态评估较好的胚胎。③复苏的温度,通常在37度预热的解冻液中进行,避免重结冰。

(二)卵母细胞的冻存

1.历史回顾

1986年报道了第1例经冻存的成熟卵母细胞出生的婴儿,1997年报道了第1例冻融卵母细胞经卵母细胞内单精子注射(ICSI)技术出生的婴儿等。已有研究证实卵母细胞冻存时间的长短对妊娠结局没有明显影响,这些成果为那些想要通过卵母细胞冻存保留生育能力的患者带来了希望。

2.卵母细胞的特点

成熟卵母细胞体积相对较大,细胞骨架结构和大量的细胞质对温度变化很敏感,而且细胞损伤的修复能力很差。在冻融过程中常发生细胞纺锤体、细胞骨架和透明带的损伤。卵母细胞冻存的技术尚未成熟,与胚胎和精子冻存相比。成熟卵母细胞解冻后的存活率比较低。ICSI技术使冻融后期卵母细胞的受精率和妊娠率较前升高,原因之一是应用解决了透明带硬化问题。

3.玻璃化冷冻卵子的效果

来自McGill 生殖中心的报告显示,玻璃化冷冻卵子的复苏率为81%,受精率为76%,妊娠率为45%,出生率为40%。最近的一项统计数据表明,冻卵出生婴儿先天畸形的比率为1.3%,与美国CDC报告的新生儿出生缺陷比率相类似。

4.卵母细胞冻存的生育力保护优劣

卵子冷冻虽然能够较好地避免肿瘤细胞的重新种植,但这一方法要求肿瘤患者在放化疗前首先接受超促排卵治疗,意味着这些患者的肿瘤治疗需要延迟近1个月的时间。超促排卵药物在某些癌症患者中也往往是禁忌使用的。②卵母细胞对低温的敏感性很强,冷冻保存后卵母细胞活力、受精率及其发育能力均明显降低。③适用于未婚,也没有性伴侣的患者该法较好,④无法解决生殖内分泌问题。

5.影响卵母细胞冷冻的因素

1)冷冻保护剂的影响

有研究认为PROH比甘油和DMSO相比,解冻后形态正常率和受精率效果更好,PROH使细胞质变为无定型状态,提高了膜的渗透性。而乙二醇(EG)又优于PROH。多数研究者都是将15%EG15%DMSO 添加0.6 mol /L 蔗糖作为一种相对稳定的冷冻溶液,需要注意的是:卵母细胞与DMSO 的接触时间过长(5 min37)会导致卵母细胞自发激活,诱发孤雌生殖。

2)冷冻保存方法

由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的程序化冷冻仪,推广应用并不广泛。现在常用快速冷冻方法即玻璃化法冷冻。

①卵母细胞成熟阶段与冻存效果

成熟卵由于处于MⅡ期中期,纺锤体对低温十分敏感,冷冻过程中更容易受到损伤,增加非整倍体出现的几率。而未成熟卵母细胞(GV 期和MⅠ期)体积小,尚未形成纺锤体,更适合冷冻保存。但面临解冻后体外成熟的技术挑战

②卵丘细胞对冻存效果的影响     

研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多,解冻后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细胞前后变化,发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟,如果去除卵丘细胞,成熟率则会大幅度降低。

结语:随着ICSI技术在临床中广泛应用以后,冻融后期卵母细胞的受精率和妊娠率较前升高,原因之一是应用解决了透明带硬化问题。但冻存若导致减数分裂纺锤体结构变化,出现非整倍体,GV期卵子出现核碎裂等微细结构的变化直接影响了冷冻卵子的复苏率、受精率和发育潜能。有报道冻卵的受精率从最初的40%已提高到80%左右,但仅有约50%的卵子能继续卵裂,而流产率仍高达20%-50%。说明冷冻保存可能严重影响了卵子的发育潜能,深入的研究和观察还要继续。

精彩课程